Chromatographie

Dünnschichtchromatographie von Blattfarbstoffen

Chromatographie, Chromatografie (griechisch, χρῶμα chroma „Farbe“ und γράφειν graphein „schreiben“, zu deutsch Farbenschreiben) wird in der Chemie ein Verfahren genannt, das die Auftrennung eines Stoffgemisches durch unterschiedliche Verteilung seiner Einzelbestandteile zwischen einer stationären und einer mobilen Phase erlaubt. Dieses Prinzip wurde erstmals 1901 von dem russischen Botaniker Michail Semjonowitsch Zwet beschrieben, 1903 wurde es zum ersten Mal öffentlich gedruckt beschrieben, 1906 benutzte er erstmals den Begriff „Chromatographie“. Er untersuchte gefärbte pflanzliche Extrakte, zum Beispiel aus Blattmaterial, und konnte daraus durch Chromatographie verschiedene Farbstoffe isolieren. Anwendung findet diese Methode zum einen in der Produktion zur Reinigung von Substanzen (= präparative Chromatographie), zum anderen in der chemischen Analytik, um Stoffgemische in möglichst einheitliche Inhaltsstoffe zwecks Identifizierung oder mengenmäßiger Bestimmung aufzutrennen. Die Chromatographie wird in der organischen Chemie, der Pharmazie, der Biochemie, der Biotechnologie, der Mikrobiologie, der Lebensmittelchemie, der Umweltchemie und auch in der anorganischen Chemie angewendet.

Prinzip der Chromatographie

Zusammenhänge in der Chromatographie und Vergleiche

Die Chromatographie lässt sich am einfachsten durch einen Vergleich erklären:

Ein reißender Fluss kann einiges an Treibgut mit sich führen. Die Geschwindigkeit, mit der das Treibgut weiterbewegt wird, hängt ab

In der Chromatographie werden unterschiedliche Substanzen (= Treibgut) in der so genannten mobilen Phase (= Wasser) auf einer stationären Phase (= Flussbett) befördert. Aufgrund der Wechselwirkungen (siehe die Einteilung unter Trennprinzipien) zwischen der Probe, der stationären Phase und der mobilen Phase werden einzelne Substanzen unterschiedlich schnell weitertransportiert und somit voneinander getrennt: Ein Gemisch aus Sand, sehr kleinen und etwas größeren Kieselsteinen wird an einer Stelle des Flusses eingebracht; nach beispielsweise hundert Metern kommt zuerst der gesamte Sand an (verteilt auf ein paar Meter) und nach einer gewissen Wartezeit kommen alle kleineren Kieselsteine und noch viel später die größeren, jeweils auf eine gewisse Strecke auseinandergezogen.

Dieser Vergleich eignet sich für einen ersten Einstieg. Tatsächlich erinnert der Prozess (bei der Chromatographie) eher an einen „digitalen“ Prozess (engl. „stop and go“). Die Probemoleküle werden entweder mit der mobilen Phase mitgenommen (mit der Geschwindigkeit der mobilen Phase – Analogie wäre ein Floß, das passiv in einem Strom mitgeführt wird) oder sie haften an der stationären Phase (Geschwindigkeit gleich Null). Zwischen diesen beiden Möglichkeiten wechseln sie sehr rasch hin und her (aufgrund der Wärmebewegung erhalten sie ständig Stöße). Der Vergleich mit dem Flussbett könnte auch zu einem weiteren Missverständnis führen: die Verzögerungen, die die verschiedenen Probemoleküle auf dem Weg durch das chromatographische System erleiden, haben nichts mit Reibungsphänomenen zu tun. Basis für das Verständnis sind Unterschiede in der Verteilung (der verschiedenen Molekülsorten A, B, C usw.). Sie entsprechen Unterschieden im Zeitanteil (den die einzelnen Moleküle vom Typ A, B, C usw. im Mittel in der mobilen Phase verbringen). Die Chromatographie schafft es, diese Unterschiede in Geschwindigkeitsunterschiede zu verwandeln und damit für eine Trennung gut nutzbar zu machen. Das könnte man auch als den „Trick“ oder als das Prinzip der Chromatographie bezeichnen. Ansonsten wären diese oft recht kleinen Unterschiede kaum zu nutzen, weder für Trenn- und Reinigungsprozesse, noch für Analysen.

Anhand eines Beispiels ist es leichter zu verstehen: Wenn sich 45 % der A-Moleküle in der mobilen Phase aufhalten (im Mittel), kommt es auf Grund des dynamischen Gleichgewichtes dazu, dass die individuellen A-Moleküle auch 45 % der Zeit in der mobilen Phase verbringen (im Mittel). Daher wird ihre Geschwindigkeit 45 % der Geschwindigkeit der mobilen Phase betragen (im Mittel). Für gute Ergebnisse bei der Chromatographie ist es entscheidend, dass der Stoffaustausch zwischen den beiden Phasen sehr rasch erfolgt, das heißt die einzelnen Probemoleküle sollen sehr oft zwischen den beiden Phasen hin und her wechseln (Diffusionsprozesse, Wärmebewegung). Eine Voraussetzung dafür ist, dass die Wege, welche die Moleküle von der stationären Phase zur mobilen Phase zurückzulegen haben, sehr kurz sind. Falls die stationäre Phase ein Pulver enthält, sollte die Korngröße dieses Pulvers sehr klein sein (zum Beispiel nur wenige Mikrometer). Aus bestimmten Gründen sollten die Pulverkörner auch möglichst einheitlich geformt sein und eine möglichst einheitliche Größe aufweisen (enge Korngrößenverteilung).

Prozess

Schematische Darstellung

Für die Chromatographie sind die Herstellung des Flusses der mobilen Phase, die Injektion der zu trennenden Probe, die eigentliche Trennung und die Detektion nötig. Das Fließen der mobilen Phase wird entweder mittels Druck (hydraulischen Pumpe, Gasdruck), Kapillarkraft oder durch Anlegen einer elektrischen Spannung erreicht.

Die Injektion (= Einbringen des Substanzgemisches in das chromatographische System) erfolgt entweder, bevor der Fluss der mobilen Phase hergestellt wird (z.B. Dünnschichtchromatographie) oder während die mobile Phase bereits fließt. Bei einer großen Anzahl von Proben werden bei automatisierbaren Chromatographiearten sogenannte Autosampler (zusammen mit eigenen Datenerfassungssystemen) eingesetzt, die vollautomatisch die Proben injizieren.

Anschließend erfolgt die eigentliche Auftrennung des Substanzgemisches auf der Trennstrecke. Ohne Detektion (= sichtbar machen, wann eine Substanz einen bestimmten Teil des Chromatographiesystems passiert oder wo eine Substanz nach dem Beenden des Prozesses zum Liegen kommt) ist eine Chromatographie nicht denkbar. Für jede Chromatographieart werden verschiedene Detektionssysteme eingesetzt, indem entweder physikalische Eigenschaften (Absorption von Licht, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Wärmeleitfähigkeit.) der Substanzen ausgenutzt werden oder durch chemische Reaktionen ein Signal erhalten wird. Mittels chemischer Reaktionen wird z.B. eine Färbung bei der planaren Chromatographie erreicht (z.B. Aminosäuren mittels Ninhydrin) oder Reaktionen vor dem Auftrennen (Vorsäulenderivatisierung) oder nach dem Auftrennen (Nachsäulenderivatisierung) bei der Säulenchromatographie durchgeführt.

Bei der präparativen Chromatographie wird anschließend noch ein Fraktionensammler zum Auffangen der aufgetrennten Substanz benötigt.

Bauartbedingt handelt es sich bei chromatographischen Aufreinigungsverfahren immer um Batch-Verfahren. Dies bedeutet, dass immer nur eine bestimmte Menge an Substanz aufgetragen und getrennt werden kann, bevor mit der nächsten Menge fortgefahren werden kann. Dies ist insbesondere bei der Aufarbeitung großer Mengen problematisch, so dass einige Verfahren entwickelt wurden, um Chromatographie kontinuierlich betreiben zu können: Annulare Chromatographie, TMB (True Moving Bed) Chromatographie und SMB-(Simulated Moving Bed) Chromatographie.

Begrifflichkeiten und Prinzip

Stationäre Phase

Phase, die mit den einzelnen Substanzen des Substanzgemisches Wechselwirkungen eingeht und sich nicht bewegt. Der Aufenthalt der Analyten bei ihrer Retention wechselt zwischen mobiler und stationärer Phase (random walk) und verursacht die substanzcharakteristische Retentionszeit. Die stationäre Phase besteht in der Gaschromatographie aus einer Flüssigkeit (Trennflüssigkeit) oder einem Gel, mit welchem die Innenseite der Kapillare beschichtet ist. Bei der Flüssigchromatographie ist die stationäre Phase normalerweise fest, kann aber auch eine Flüssigkeit sein, die mit der mobilen Phase nicht mischbar ist und den pulverförmigen Träger benetzt. Schließlich kann die stationäre Phase auch aus chemisch an den Träger gebundenen Molekülen bestehen.

Mobile Phase

Phase, in die das Substanzgemisch zu Beginn des Trennsystems eingebracht und die bewegt wird. Bei der Flüssigchromatographie ist die mobile Phase flüssig. Bei der Gaschromatographie kommen Trägergase wie Wasserstoff, Helium oder Stickstoff zum Einsatz, in der Dünnschichtchromatographie spricht man vom Fließmittel. Mobile Phasen unterscheiden sich in ihrer Elutionsfähigkeit („Stärke“ s.u. „Elutrope Reihe“), dies bedingt unterschiedliche Retentionszeiten und oft auch unterschiedliche Selektivitäten.

Retention

Unter Retention versteht man den verzögerten Durchfluss einzelner Substanzen des Substanzgemisches der mobilen Phase durch Wechselwirkung mit der stationären Phase.

Die Retention einer Substanz durch die stationäre Phase wird im Wesentlichen durch drei Aspekte bestimmt:

In vielen Fällen wird gezielt eine spezielle Wechselwirkung des zu analysierenden Stoffes mit der stationären Phase genutzt, um Substanzen zu trennen. Die Stärke der Wechselwirkungen zwischen den Probenkomponenten und der stationären Phase wird sowohl von deren Struktur als auch von deren funktionellen Gruppen bestimmt. Dabei treten bei unpolaren Substanzen ausschließlich Dispersionswechselwirkungen (Van-der-Waals-Bindung) auf, während polare Trennphasen auch polare Wechselwirkungen eingehen können, etwa Wasserstoffbrückenbindungen oder Donator-Akzeptor-Bindungen. Letztere trennen nach dem Prinzip: Gegensätze ziehen sich an. Das bedeutet, dass Trennphasen, die etwa Wasserstoff zur Wasserstoffbrückenbindung aufzunehmen in der Lage sind Substanzen trennen, die Wasserstoff zur Brückenbindung bereitstellen können (etwa Alkohole). Auch können zum Beispiel Enantiomere, welche sich in ihren Siedepunkten nicht unterscheiden und somit gleiche Retentionszeiten aufweisen würden, durch ihre verschieden starken Wechselwirkungen mit speziellen Derivaten von Cyclodextrinen aufgetrennt werden.

Retentionszeit

Zeit, die die Moleküle eines reinen Stoffes zum Durchwandern der Säule benötigen (von der Injektion bis zur Detektion).

Im Gegensatz zu den Trägergasen zeigen die meisten chemischen Stoffe eine Wechselwirkung mit der stationären Phase, d.h., sie halten sich für eine gewisse Zeit in der stationären Phase auf. Ihre Aufenthaltsdauer in der stationären Phase addiert sich zur Aufenthaltsdauer in der mobilen Phase (Totzeit), sie benötigen also insgesamt länger, um die ganze GC-Säule zu passieren. Ursprünglich leitet sich der Begriff Retention (Zurückhaltung) davon ab, dass die stationäre Phase den Analyten für eine gewisse Zeit zurückhält. Heutzutage wird der Begriff Retentionszeit allerdings vereinfacht verwendet für die Zeit, die der Analyt zum Passieren der Säule benötigt und dies schließt also die Totzeit mit ein. Daher werden die Begriffe folgendermaßen definiert:

Durchflusszeit (Totzeit)

Die Durchflusszeit (auch „Totzeit“) gibt die Zeit an, die die mobile Phase oder eine nicht zurückgehaltene Substanz benötigt, um die Chromatographie-Apparatur von der Injektion über die Säule bis zum Detektor zu durchwandern (s.a. Durchflussvolumen). Die Durchflusszeit kann bestimmt werden, indem eine nicht zurückgehaltene Substanz („Inertsubstanz“) injiziert wird. Diese Substanz geht nur in sehr geringem Maße Wechselwirkungen mit der stationären Phase ein. Sie durchläuft daher die Apparatur in derselben Zeit wie die mobile Phase. Die Durchflusszeit ist dann identisch mit der Zeit zu der der Peak im Detektor erscheint.

Durchflussvolumen

Das Durchflussvolumen kann direkt aus der Durchflusszeit abgeleitet werden. Es ergibt sich aus der einfachen Formel Durchflussvolumen = Fluss der mobilen Phase · Durchflusszeit. Das Durchflussvolumen ist für zahlreiche Berechnungen in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) sehr wichtig, z.B. für den Methodentransfer zwischen Säulen mit unterschiedlichem Volumen.

Elution

Elution (von lat. eluere „auswaschen“) ist das Herauslösen oder Verdrängen von adsorbierten Stoffen aus festen oder mit Flüssigkeit getränkten Adsorbentien und Ionenaustauschern durch kontinuierliche Zugabe eines Lösungsmittels (Elutionsmittel = mobile Phase). Die aus der Trennsäule fließende Lösung wird Eluat genannt.

Eine besondere Bedeutung hat dieser Prozess in der Festphasenextraktion.

Eluotrope Reihe

Anordnung der als mobile Phase üblichen Lösungsmittel nach ihrer Elutionskraft bei einer Referenzsubstanz (i. d. R. Kieselgel oder Aluminiumoxid).

Bluten

Als Bluten wird ein Effekt bei Chromatographie-Säulen bezeichnet, bei dem die Säule geringe Anteile ihrer Matrix verliert. Man spricht auch von Säulenbluten. Ursache für verstärktes Säulenbluten können in der Gaschromatographie eine übermäßige thermische Belastung der Säule und in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) die Verwendung zum Beispiel ungeeigneter pH-Werte des Elutionsmittels oder der Eluenten (zu stark sauer oder alkalisch) sein. Säulenbluten findet in geringem Ausmaß auch im laufenden Betrieb statt und stellt dort normalerweise kein Problem dar. Durch das Säulenbluten ergibt sich, unter anderem, die Alterung von Trennsäulen. Starkes Säulenbluten bewirkt jedoch ein starkes Signalrauschen und einen hohen Hintergrundwert bei der Detektion oder nachgeschalteten Analyseverfahren, wie einem Massenspektrometer.

Säule

In der Chromatographie versteht man unter einer Säule, oder Trennsäule, eine hohle Röhre mit einem Durchmesser von wenigen Mikrometern bis zu mehreren Metern. Auch die Länge variiert von wenigen Zentimetern bis zu 150 Metern. In dieser Röhre ist entweder nur die Innenwand beschichtet (Kapillarsäule), oder die Säule ist mit der stationären Phase befüllt (gepackte Säule). Von der Säule im Bauwesen unterscheidet sie sich insofern, als sie weder gerade noch senkrecht sein muss, sondern auch wie ein Schlauch aufgerollt sein kann.

Reversed-Phase-Mechanismus

Bei der Adsorptionschromatographie gibt es zwei Möglichkeiten ein Substanzgemisch zu trennen:

  1. Normale Phase: polare stationäre Phase (wie Kieselgel, Aluminiumoxid), unpolare bis mittelpolare mobile Phase (wie Kohlenwasserstoffe, Dioxan, Essigsäureethylester …) oder
  2. Reversed Phase (Umkehrphase): unpolare stationäre Phase (wie modifiziertes Kieselgel) und polare mobile Phase (wie gepuffertes Wasser).

Im ersten Fall werden lipophile Stoffe leicht, polare schwer eluiert, im Umkehrfall polare leicht eluiert („similia similibus solvuntur“).

In der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wird oft eine Gradienteneluierung angewandt, wobei die Zusammensetzung des Lösungsmittels langsam geändert wird (z.B. von 80 % auf 20 % Wasseranteil). So treten Alkane sehr spät und Aminosäuren sehr früh aus der Säule aus und man kann diese Fraktionen herausschneiden.

Einteilung nach dem Trennprinzip

Das grundlegende Prinzip aller chromatographischen Verfahren ist die oft wiederholte Einstellung eines Gleichgewichtes zwischen einer ruhenden Phase und einer bewegten Phase. Das Gleichgewicht kann sich auf Grund verschiedener physikalisch-chemischer Effekte ausbilden.

Bei einem Sieb haben Teilchen „Vorteile“, die fein genug sind, um die Poren des Siebes zu durchdringen. Bei den entsprechenden Chromatographieverfahren ist es genau umgekehrt. Genügend feine Teilchen sind in der Lage, sich in die Hohlräume der stationären Phase zu „verirren“, sind daher langsamer unterwegs als Moleküle, die auf Grund ihrer Größe aus diesen Hohlräumen (mehr oder weniger oder zur Gänze) ausgeschlossen werden. Bei genügender Größe wandern sie unverzögert, da sie sich nur im bewegten Flüssigkeitsstrom aufhalten und nie im unbewegten Teil der Flüssigkeit (in den Hohlräumen – z.B. des Gels).

Einteilung nach den verwendeten Phasen

Aufgrund der mobilen Phasen kann man die Chromatographie in drei Gebiete unterteilen, welche sich nach den Trägern der stationären Phasen oder der Dichte einteilen lassen

Kenngrößen der Chromatographie

u={\frac  {L}{t_{0}}}
k={\frac  {t_{R}-t_{0}}{t_{0}}}
\alpha ={\frac  {k_{2}}{k_{1}}}
R=2\cdot \left({\frac  {t_{{R2}}-t_{{R1}}}{b_{{B2}}+b_{{B1}}}}\right) oder
R=1{,}18\cdot \left({\frac  {t_{{R2}}-t_{{R1}}}{FWHM_{1}+FWHM_{2}}}\right)
Der Faktor 1,18 kommt durch das Verhältnis der Halbwertsbreite zur Basisbreite einer Gaußschen Glockenkurve ((2 · ln 2)0,5) zustande.
N=16\cdot \left({\frac  {t_{R}}{b_{B}}}\right)^{2}(2^{2}\cdot 4=16) oder
N=5{,}55\cdot \left({\frac  {t_{R}}{FWHM}}\right)^{2}(1{,}18^{2}\cdot 4=8\cdot \ln 2=5{,}54)
b_{B} : Basislinienbreite
FWHM : „Full Width at Half Maximum“ Fwhm
n=1+{\frac  {{\sqrt  {N}}}{4}}\cdot \ln(1+k_{{\text{max}}})
H={\frac  {L}{N}}
Praktische Werte liegen im Bereich von 0,1 bis 0,5 mm.

Trennstufenhöhe H

Die Trennstufenhöhe einer chromatographischen Säule ist ein Maß für die Trennleistung der Säule. Als Trennstufe kann man sich den gedachten Abschnitt der Trennsäule, auf dem sich das chromatographische Gleichgewicht einmal einstellt, vorstellen. Je mehr solche Gleichgewichtseinstellungen „auf der Säule Platz haben“, umso geringer ist die Trennstufenhöhe und umso höher ist die Trennleistung der Säule. Zur Erlangung einer niedrigen Trennstufenhöhe sind unter analytischen Bedingungen folgende Voraussetzungen nötig:

  1. Es wird eine rasche Gleichgewichtseinstellung der Adsorption oder Verteilung erwartet. Daher sollte der Teilchendurchmesser so klein wie möglich sein.
  2. Konstante Temperatur in der gesamten Säule. Dazu kann ein Säulenthermostat benutzt werden.
  3. Konstante Fließgeschwindigkeit: Hierfür wird eine Kolbenpumpe mit bis zu 400 bar verwendet.
  4. Linearer Adsorptionsbereich: Die stationäre Phase sollte im Verlauf der Chromatographie nicht überladen werden.
  5. Vernachlässigbare Diffusion wäre wünschenswert, ist experimentell aber leider nicht erreichbar. Es werden daher möglichst regelmäßige Packungen mit Teilchen von besonders kleinem Durchmesser verwendet.

Zur Ermittlung der Trennstufenhöhe in Abhängigkeit von der Fließgeschwindigkeit des Eluenten kann die sog. Van-Deemter-Gleichung für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie herangezogen werden:

H=A+{\frac  {B}{u_{x}}}+C\cdot u_{x}

wobei:

Peaksymmetrie

Theoretisch sollte jede Substanz eine Chromatographiesäule als scharf eluierende Linie verlassen. Aus verschiedenen Gründen besitzen chromatographische Peaks jedoch immer eine gewisse Breite. Im Idealfall weisen sie dabei die Form einer Gauß’schen Glockenkurve auf. In der Praxis kommt es aber häufig vor, dass die Peaks von dieser Idealform abweichen und mehr oder weniger asymmetrisch erscheinen. Eine Asymmetrie, bei der der Frontanstieg des Peaks steiler ist als der Peakabfall, bezeichnet man als „Tailing“, während der Effekt, dass der Anstieg weniger steil ist als der Abfall als „Fronting“ oder auch „Leading“ bezeichnet wird. Der Tailingfaktor, der ein Maß für die Peaksymmetrie darstellt, wird bestimmt, indem man vom Peakmaximum das Lot zur Basislinie fällt, und in einer bestimmten Höhe, meist in 10 % der Peakhöhe, die Abstände zur Peakfront (a) und zum Peakende (b) ermittelt. Anschließend wird der Quotient der beiden Werte gebildet, wobei unterschiedliche Berechnungsformeln (z.B. nach IUPAC oder nach USP) in Gebrauch sind:

Drei Peaksymmetrien

Ein idealer „Gauß-Peak“ erreicht dabei den Wert 1, Werte über 1 bedeuten „Tailing“, Werte unter 1 dagegen „Fronting“.

Verfahren

Literatur

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Basierend auf einem Artikel in: Wikipedia.de
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Datum der letzten Änderung: Jena, den: 27.02. 2022